Moderní alternativa léčby bércových vředů

Chronické ulcerace dolních končetin představují závažný zdravotní problém jak ve smyslu morbidity, tak i svou ekonomickou náročností pro společnost. Udává se, že ve vyspělých zemích trpí bércovými vředy 0,5 - 1,5 % populace. Terapie zahrnuje jak postupy konzervativní, tak chirurgické, mnohdy i při hospitalizaci pacienta. V konzervativní terapii se kromě klasických postupů stále častěji uplatňují moderní obvazová krytí (hydrokoloidy, hydrogely, polyuretanové folie aj.), která dovolují hojení rány ve vlhkém prostředí, čímž snižují bolestivost, urychlují granulaci, angiogenezu a epitelizaci. V moderní terapii se v posledních patnácti letech začaly používat i tzv. aktivní buněčné kryty - kultivované epidermální keratinocyty v podobě autograftů či allograftů.

Základem metody byla průkopnická práce Rheinwalda a Greena. Tito badatelé překonali omezení v proliferaci savčích buněk subkultivací humánních epidermálních keratinocytů v kultuře in vitro, což umožnilo mnohonásobně tyto buňky pomnožit. Metoda byla dále zdokonalena a v roce 1981 v USA byly poprvé použity kultivované autologní keratinocyty u mladého pacienta s těžkými popáleninami, a to s velmi dobrým efektem. O dva roky později byly publikovány výsledky prvního použití allograftů kultivovaných epidermálních buněk rovněž u popáleného pacienta. Postupně se kultivované epidermální keratinocyty začaly využívat v širokém měřítku zejména v oblasti popáleninové medicíny, kde hrají nezastupitelnou roli u popálenin stupně IIb. V terapii chronických bércových vředů byly kultivované epidermální keratinocyty poprvé použity v r. 1986. Metoda našla uplatnění i při terapii kongenitálních névů, tetováží a některých forem epidermolysis bullosa. Způsob kultivace

Kultivované epidermální keratinocyty jsou připravovány v laboratoři ve sterilním prostředí. Malý vzorek kůže získaný biopsií je trypsinizován, takže dojde k separaci epidermis od dermis. Izolované keratinocyty jsou resuspendovány v živném roztoku s růstovými faktory a poté inokulovány na výživnou vrstvu (např. 3T3 myší fibroblasty). Kultivace probíhá v plastikových lahvích v přesně definovaných podmínkách. Již po 24 hodinách vznikají kolonie nových buněk, po 3 dnech dochází ke spojování buněčných kolonií a asi po týdnu se vytváří souvislý "monolayer" epitelových buněk. Primokultura je většinou seriově subkultivována, čímž dojde k mnohonásobnému pomnožení buněk. Další kultivací vzniká "multilayer", v 

němž už dochází k diferenciaci buněk.

V terapii chronických ulcerací lze použít jak autografty, tak allografty, přičemž buňky mohou být nativní, kryoprezervované nebo lyofilizované.

Kultivované epidermální autografty

Zdrojem keratinocytů pro kultivaci je v tomto případě kůže pacienta, jedná se tedy o autologní keratinocyty. Kultivované epidermální autografty proto představují trvalé kožní kryty. Další výhoda spočívá v možnosti krytí velkých ploch štěpy z jedné malé kožní biopsie, s dobrými kosmetickými výsledky. Kryoprezervace buněk umožňuje okamžité použití u téhož pacienta v budoucnu.

Použití autologních keratinocytů ale s sebou přináší, zvláště u starších pacientů - kterých je však většina - několik nevýhod. Je nutno odebrat biopsii, která bývá bolestivá, autografty jsou k dispozici až za 3-4 týdny (zhruba tuto dobu trvá kultivace) a navíc je známo, že keratinocyty starších lidí mají in vitro menší růstový potenciál.

Kultivované epidermálni allografty

Zdrojem keratinocytů pro kultivaci je v tomto případě kůže dárce, jedná se tedy o allogenní keratinocyty. Dárcem může být: 1. pacient podstupující elektivní plasticko-chirurgický výkon (např. operace apostázy, ptózy víček, fimózy aj.), 2. kadaverózní dospělý dárce, 3. kadaverózní fétus. Podmínkou je pečlivý screening - vyloučení dárců s infekčními chorobami, malignitami, negativní serologické vyšetření přenosných onemocnění (v ČR je povinný screening HIV 1, 2, HbsAg, HCV, RRR a TPHA) . 

Výhodou allograftů je jejich okamžitá dostupnost, neinvazívnost (odpadá nutnost kožní biopsie), promptní úleva od bolesti po jejich aplikaci. Podstatný je i fakt, že neonatální keratinocyty mají vysoký růstový potenciál. Nevýhodou je možnost přenosu

infekčních onemocnění. Mechanismus účinku kultivovaných epidermálních allograftů dosud není plně objasněn. Zpočátku se někteří autoři domnívali, že allografty představují trvalé kožní kryty. Vycházeli z toho, že nepřítomnost Langerhansových buněk v allograftech zabezpečuje toleranci štěpu proti HLA. Brzy se však ukázalo, že allografty jsou rychle kolonizovány Langerhansovými buňkami a že dochází k odhojení allograftů jak u zvířat, tak u lidí. Pomocí analýzy DNA bylo prokázáno, že allogenní keratinocyty jsou postupně nahrazovány hostitelskými (vlastními) buňkami. Hlavní význam allograftů při urychlení hojení spočívá především v tom, že uvolňují řadu cytokinů. Tyto cytokiny stimulují migraci a proliferaci reziduálních hostitelských keratinocytů z okrajů rány a z kožních adnex a rovněž modulují replikaci fibroblastů a syntézu kolagenu. Mezi nejdůležitější cytokiny produkované kultivovanými keratinocyty patří EGF (epidermal growth factor), TGF-alfa, beta (transforming growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), fibronektin, IL-l a řada dalších.Vzhledem k tomu, že v současné době není známo složení všech cytokinů ani jejich vzájemný poměr, ani přímá aplikace cytokinů nepřináší výsledky srovnatelné se sekrecí živé dárcovské epidermální buňky. Epitelizace začíná většinou z okrajů rány (tzv. "edge effect"), což souvisí s výše popsaným mechanismem účinku (stimulace migrace hostitelských keratinocytů). Vzácnější tvorba epitelizačních ostrůvků v centru rány bývá připisována migraci hostitelských keratinocytů ze zbytků kožních adnex.

Keratinocyty nativní

Nativní keratinocyty jsou získány expanzí keratinocytů v podmínkách in vitro a ihned aplikované v nativním stavu.

Keratinocyty kryoprezervované

Kryoprezervace je proces, při kterém dojde k prosycení buněk kryoprezervačním médiem a následnému zmrazení. Keratinocyty jsou skladovány při teplotě -80°C až -150°C. Výhodou je, že kryoprezervované štěpy mohou být vytvořeny v laboratoři ve větším množství a uschovány v tkáňové bance, kde jsou kdykoliv připraveny k okamžitému použití. Kryoprezervace výrazně redukuje problémy spojené s dostupností a transportem kultivovaných epidermálních keratinocytů. Dají se transportovat a jejich aplikace je snadná, zcela nezatěžující pro pacienta. Přitom kryoprezervované štěpy v porovnání s nativními štěpy dávají zcela srovnatelné výsledky při terapii bércových ulcerací.

Keratinocyty lyofilizované

Lyofilizace je proces, při kterém dojde k zmrazení buněk na teplotu -80°C a následné sublimaci vody ve vakuu. Sterilita je zajištěna ozářením dávkou 25 kGy. Lyofilizace

umožňuje jak skladování, tak i transport kultivovaných keratinocytů při pokojové teplotě, což je nesporně velkou výhodou oproti štěpům kryoprezervovaným, které vyžadují skladovací teplotu -80°C a transport s použitím suchého ledu.

Na rozdíl od kryoprezervovaných štěpů, u kterých zůstává zachována vitalita keratinocytů, dochází u lyofilizace ke vzniku lyzátů keratinocytů, tzn., že buňky ztrácejí svou vitalitu. Lyzáty si však uchovávají podobné složení jako vitální keratinocyty, tj. obsahují stejné cytokiny. Z tohoto důvodu by měly mít lyofilizované keratinocyty velmi podobný efekt jako nativní či kryoprezervované keratinocyty. Použitím lyofilizovaných keratinocytů se dosud zabývalo několik autorů. Jedním z prvních byl Duinslaeger, který prokázal, že lyofilizované lyzáty keratinocytů stimulují hojení ran u popálených pacientů s efektem velmi podobným nativním allograftům keratinocytů.

Závěr

Kultivované epidermální keratinocyty urychlují hojení ran včetně bércových vředů. Léčebný účinek spočívá především v tom, že uvolňují řadu cytokinů, které stimulují migraci a proliferaci reziduálních hostitelských keratinocytů z okrajů rány a z kožních adnex a rovněž modulují replikaci fibroblastů a syntézu kolagenu.

Nabízí se samozřejmě argument, že lze aplikovat jednotlivé cytokiny syntetické, získané rekombinantní DNA technologií. Tyto syntetické růstové faktory jsou však extrémně finančně nákladné, nejsou všeobecně k dispozici a navíc v současné době není známo přesné složení všech cytokinů, jejich vzájemný poměr ani synergistické či antagonistické interakce mezi jednotlivými cytokiny. Nelze opomenout i fakt, že některé růstové faktory jsou produkovány ve formě prekurzorů. Vzhledem k tomu, že keratinocyty obsahují cytokiny ve fyziologickém množství, ve vysoce stabilizované formě, mohou být klinicky mnohem účinnější než aplikace jednoho růstového faktoru. Kultivované epidermální keratinocyty se používají k léčbě dlouhodobých, na terapii rezistentních ulcerací.

Nejlepších výsledků bývá dosaženo u ulcerací venózní etiologie. Kultivované epidermální keratinocyty výrazně urychlují hojení bércových vředů, čímž jednoznačně zlepšují kvalitu života pacientů.

^{Autor: Lubomír Škrabák}

^{Zdroj: Listy Celiaků}